同一級生物安全柜一樣，氣體也是從外部流入二級生物安全柜，通常稱為進流。進流能夠防止微生物操作時產生的氣溶膠從安全柜前面操作窗口逃逸到實驗室內。然而，它們不同于一級生物安全柜之處為，只讓經HEPA過濾的(無菌的)空氣流過工作臺面。內置風機將空氣經前面的開口引入安全柜內并進入前面的進風格柵。因此沒有經過過濾器過濾的空氣不會直接進入工作區，從而保護安全柜內部存放的樣品和儀器不被外界空氣所污染。
二級生物安全柜的其中一個特點就是由垂直層狀薄片的(無定向的)HEPA過濾器過濾后，再安全柜內部形成向下流動的氣流。氣流不斷地沖能可產生空氣傳播感染的安全柜內部，從而避面存放在柜體內的樣品受到感染。這樣的氣流被稱作下沉氣流。
不同型號的二級生物安全柜的主要區別在于排氣的比例以及氣體經過空氣高壓再循環的比例不同。另外，不同的二級生物安全柜具有不同的排氣方式：有的安全柜將空氣過濾后直接排到室內，有的是通過連接到專用通風管道上的套管或通過建筑物的排風系統排到建筑物外面。
二級生物安全柜的主要結構：
1.頂部聚風罩（可接外排管道，選配件）；
2.無框架前窗，可提供更廣闊，無障礙操作視野；
3.整塊不銹鋼操作臺面，一體成型，方便清潔；
4.內置插座電源；
5.操作按鍵位于前面板中心，方便操作；
6.可選不同類型的支架（平角支架，萬向輪支架，液壓伸縮支架）。
二級生物安全柜的氣流模式探討：
進氣流：氣體流入操作臺面的進氣隔柵，不進入工作區域避免了樣品/產品污染。
氣體回流路徑：進氣流順著操作臺后面的回流路線向上流動并和從后面隔柵流入下沉氣流相遇。此混合氣體流入后面的回風腔內，然后在進入風機入口前形成負氣壓。風機在頂部產生正氣壓。如果正氣壓處有泄漏，此泄漏將被周圍的負氣壓推回正氣壓室，從而避免泄漏。
約32%的氣體經上方ULPA超高效過濾器過濾后排出，從而阻止污染物排入外界環境。剩下的68%的空氣經下沉氣流ULPA超高效過濾器過濾后，形成可再循環潔凈氣流，避免柜內產品/樣品的受到污染。
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